ВИРУС ГЕПАТИТА С, ВГС
(Hepatitis С Virus)
— возбудитель гепатита С. Ранее обозначали как вирус, вызывающий гепатит "ни-А, ни-В", передающийся парентерально, или агентом, который вызывает гепатит с формированием тубулярных структур в цитоплазме гепатоцитов. ВГС. был идентифицирован группой американских исследователей под руководством М. Хоутона в 1989 году путем клонирования генома и установления его принадлежности к самостоятельному вирусному агенту, ассоциированному с посттрансфузионным гепатитом «ни-А, ни-В».
Несмотря на то, что не удается получить ВГС в количествах, позволяющих провести его исчерпывающее электронномикроскопическое и вирусологическое изучение, определены следующие характеристики вируса гепатита С: диаметр вириона — 50 нм (по данным различных исследователей от 30 до 60 нм);
чувствительность к действию хлороформа; наличие белковой оболочки, коэффициент седиментации — не менее 150 S. Исследование плавучей плотности ВГС, полученного in vivo и in vitro, установило различия в их коэффициентах седиментации. Вирус, выделенный из плазмы больного острым гепатитом С и экспериментально зараженной шимпанзе, имел плавучую плотность в градиенте сахарозы — 1,06 г/см 3, тогда как плотность вируса полученного на культуре клеток,— 1,12 г/см 3. Считают, что более низкая плавучая плотность ВГС, полученного in vivo, определяется его ассоциацией с липопротеинами низкой плотности, что может способствовать проникновению вируса в гепатоцит. Обнаружение в сыворотке крови больных хроническим гепатитом С частиц с высокой плавучей плотностью 1,17 г/см 3 связывают с наличием комплекса ВГС с антителами.
ВГС инактивируется при температуре +60° С — в течение 30 минут, а при 100° С — за 2 минуты.
Геном ВГС представлен однонитевой линейной молекулой РНК положительной полярности протяженностью около 9400 нуклеотидов. Результаты клонирования и полного секвинирования РНК ВГС, а также физико-химические характеристики вируса позволили отнести ВГС к семейству Флавивирусов, выделив в отдельный род Гепацивирусов. Сравнительный анализ РНК ВГС с геномами других вирусов, входящих в данное семейство, выявил сходство с фрагментами геномов вирусов Денге второго типа и вируса пятнистости гвоздики (группа кариновирусов). Кроме того, зарегистрированы так называемые «локальные» гомологии (не более 16 нуклеотидов в регионе) с пестивирусами (вирус холеры свиней и вирус бычьей диареи). Наличие гомологии РНК ВГС и с геномами вирусов растений позволило предположить, что ВГС занимает промежуточное положение в эволюции вирусов между вирусами животных и растений.
Организация генома ВГС подобна организации геномов других флавивирусов (например, вируса желтой лихорадки). В РНК ВГС выделяют зоны, кодирующие структурные и неструктурные (функциональные) белки.
Гены, кодирующие структурные белки, расположены у 5' области генома вируса, а неструктурные — у 3' области. На концах РНК ВГС имеются некодирующие участки размером приблизительно 340 и 60 оснований. РНК ВГС содержит единственную открытую рамку считывания, несущую информацию о вирусспецифическом полипротеине, размером около 3000 аминокислотных остатков, который, благодаря действию нескольких протеолитических энзимов вирусного и клеточного происхождения, разделяется на отдельные белки.
Установлено, что 5' область генома ВГС, кодирующая структурные белки вируса, короче аналогичных областей флави- и пестивирусов. Считается, что эта зона контролирует синтез четырех белков: Кор-белка — негликолизированного гидрофильного протеида (р 19), считающегося нуклеокапсидным белком; двух оболочечных белков, кодированных зоной Е1 (р18 и gp33) и Е2, ранее идентифицированной как зона ВГС-NSl, (р38 и gp72) и небольшого белка с неустановленной функцией. Белки, синтезированные с участков гена Е1 и Е2, считают гликопротеидами внешней оболочки вируса гепатита С (Env). Они играют роль в прикреплении и проникновении вируса в клетку. Высказывается предположение, что белки, кодируемые структурной зоной РНК ВГС, могут быть мишенью для нейтрализующих и протективных антител, т.е. эти белки, возможно, будут использованы для изготовления вакцины против гепатита С.
Область РНК ВГС, кодирующая неструктурные белки, состоит из следующих участков: NS2, NS3, NS4a, NS4b, NS5a и NS5b. Белки, синтезированные с зон NS2 (р 23) и NS4 (р10 и р27), предположительно связывают с клеточной мембранной функцией. Белок, кодированный NS4a зоной, — многофункциональный полипротеид. Он обладает стабилизирующей функцией и способствует протеиназной/хеликазной активности белка, кодированного зоной, NS3. Кроме того, он регулирует фосфорелирование белка (р70), кодированного зоной NS5a, который обладает функцией репликазы. Кристаллографический анализ ВГС — хеликазы продемонстрировал наличие трех доменов, необходимых для репликации вируса. Предполагают, что информация, полученная при изучении данных структур, может стать основой изготовления лекарственных препаратов, ингибирующих ВГС- репликацию. Зона NS5b несет информацию о белке (р56), функция которого окончательно не установлена, однако считается, что он представляет собой РНК-зависимую РНК- полимеразу, необходимую для репликации вируса.
На 5' и 3' — концах РНК ВГС расположены нетранслируемые регионы. На 3' конце он состоит приблизительно из 50 нуклеотидов — полипиримидиновый (или полипуриновый) тракт.
Особенностью ВГС является чрезвычайно высокая гетерогенность его генома. Сравнительный анализ РНК изолятов ВГС, вы деленных не только в различных странах или в пределах одного государства, но даже от одного и того же больного на протяжении инфекции, выявил их вариабельность. Отличия в нуклеотидных и аминокислотных последовательностях определены в участках РНК, кодирующих как структурные, так и неструктурные белки. Вместе с тем установлено, что максимальная гетерогенность генома регистрируется в генах, кодирующих оболочечные белки вируса. Выделяют два гипервариабельных участка РНК ВГС. Первый из них протяженностью в 90 нуклеотидов, расположен на 5' конце Е2 гена (HVR1 — hypervariable region). Второй (HVR2) гипервариабельный участок РНК ВГС (21 нуклеотид) примыкает к 3' концу HVR1. Изучение последовательностей РНК ВГС у больных, чей организм ответил или не ответил на лечение препаратами интерферона, позволил выявить участок РНК в NS5a регионе, возможно отвечающим за резистентность к лечению (interferon-sensitivity determining region — ISDR).
По сравнению с вирусом гепатита В и ВИЧ, ВГС имеет более короткий период времени полужизни частицы вируса и более высокий уровень продукции. Эти показатели для вируса гепатита С составляют — около 3-х часов и 1,1 х 10^12 синтезированных вирионов в день, а для ВГВ и ВИЧ соответственно 24 и <б часов и 10^ 11 и >10^10 вирионов в день.
Анализ последовательностей РНК многочисленных изолятов ВГС, полученных в различных регионах мира, выявил существование основных групп вируса, обозначаемых типами или генотипами (с гомологией нуклеотидных последовательностей в РНК ВГС между ними менее 72%). Идентифицировано, как минимум, шесть основных генотипов вируса гепатита С, обозначаемых римскими цифрами от I до VI (по X. Окомото), или арабскими цифрами от 1 до 6 (по П.Симоне). Кроме того, исследования изолятов ВГС, полученных в Юго-Восточной Азии, позволили дополнительно выявить 5 генотипов (7—11). Сравнительный анализ гомологии РНК ВГС различных генотипов установил наличие более 100 субтипов (уровень гомологии между различными субтипами внутри генотипа — 72-86%). Кроме того, наличие различий в последовательностях в 1-14% определяет существование множественных вариантов вируса или квазивидов вируса. У инфицированного ВГС пациента одновременно могут находиться многие миллионы различных квазивидов ВГС. Их существование объясняют "ускользанием" вируса из-под иммунологического контроля организма, что определяет появление постоянно меняющихся антигенных структур вируса. Происходит постоянное соревнование между образованием новых антигенных вариантов и выработкой антигеннейтрализующих антител. Причем победителем постоянно оказывается вирус, а не иммунная система. Быстрое изменение вируса гепатита С лежит в основе длительного, возможно иногда и пожизненного, носительства ВГС.
Филогенетический анализ РНК ВГС позволил предположить, что разделение ВГС на генотипы могло произойти от 500 до 2000 лет назад, а разделение генотипа 1 на субтипы 1а и 1Ь более 300 лет назад.
При генотипировании ВГС, проведенном в различных регионах мира, установлено, что наибольшее распространение имеют генотипы Ia, Ib, 2a, 2b и За. Они доминируют в Европе, Северной Америке, Азии и Океании. В Европейских странах генотип Ib составляет — 50—91% (Германия—59%, Бельгия—65%, Венгрия—84%, Италия (Сицилия)—91%), а генотип Ia—не более 40% (Германия-32%, Дания-40%, Франция-35%). В США превалирует субтип 1а, который получил даже обозначение как "американский генотип ВГС". Частота выявления генотипов 1а и Ib в США в среднем составляет 37% и 30% соответственно. Все остальные генотипированные вирусы представлены не более чем в 10%. В Японии, Тайване, Китае (особенно в Южном Китае), Сингапуре, Индонезии и Южной Корее наиболее часто типируют генотип Ib "японский генотип ВГС" (за исключением Филиппин, где частота генотипа 1а достигает-54,5%).
Генотипы 2a и 2b имеют более ограниченное распространение в мире, чем генотипы 1а и Ib , и имеют меньший удельный вес среди генотипов, представленных на данной территории. Наиболее часто 2 генотип представлен в странах Востока. Генотип 3 наиболее распространен в Таиланде (до 50%), Северной Европе (в Великобритании до 25%) и Австралии.
В странах Средней Азии, Северной и Центральной Африке широко представлен 4 генотип ВГС. Так, среди доноров носителей ВГС в Египте он представлен в 30-40%. Генотип 5а часто выявляется среди больных хроническим гепатитом в Южной Африке, а 6 генотип был идентифицирован в Гонконге.
В России доминирует генотип Ib, составляя в различных регионах Северной Евразии — 64,7%, на Дальнем Востоке — 80-83%, а в Центрально-Черноземном и Волго-Вятском регионах России — 50-56%. Генотип Ia наиболее часто типирован в Центральном, Северо-Западном, Волго-Вятском регионах — 11,2— 21,9%, в то время как на территории Восточной Сибири, Центрально-Черноземном районе и Урале его удается выявить крайне редко (до 5%). Генотипы За, 2а и 2Ь среди лиц с наличием ВГС в России также относят к редко выявляемым (За — 5,6—18,9%, 2а и 2b — 4,7-0,5%).
Генотипирование ВГС имеет большое значение в определении стратегии интерферонотерапии хронического гепатита С и в эпидемиологических исследованиях. Считается, что больные, инфицированные ВГС генотипа 1Ь, имеют более тяжелое течение инфекции и хуже отвечают на лечение препаратами интерферона.
Применение генотипирования ВГС при изучении распространения гепатита С в различных группах населения продемонстрировало некоторые различия в частоте выявления того или иного генотипа в зависимости от пути инфицирования. Так например, в Европейских странах генотип 1а и За ассоциируется с заражением, произошедшим при внутривенном введении наркотиков, а 1Ь при переливании контаминированной ВГС крови или плазмы. В Италии установлено, что среди пациентов с ВИЧ-инфекцией чаще выявляется 1а генотип. Распространение того или иного генотипа ВГС связано с миграцией населения.
Наличие ВГС в исследуемом материале (сыворотка или плазма крови, форменные элементы крови, печеночная ткань, полученная при биопсии или аутопсии), может быть определено при выявлении РНК ВГС методом амплификации генов и ее вариантами: лигазная цепная реакция, НАСБА, Квантиплекс. Коммерческий диагностический набор для выявления РНК ВГС, выпускаемый фирмой "Roche" — "Ап1рисог" (Рош-Ампликор), позволяет выявлять 100 и более копий вируса в 1мл. Помимо качественного варианта ПЦР-анализа разработан и количественный, что особенно важно для оценки эффективности проводимой терапии. Для определения генотипов ВГС может быть использовано секвинирование значительных по протяженности участков РНК. Однако, учитывая потребность в генотипировании ВГС, разработаны тесты, основанные на анализе амплифицированных участков РНК ВГС, характерных для конкретного генотипа и/или субтипа вируса. Методологически это сводится: к амплифицированию участков Кор или NS5 гена; анализу 5' NCR, Кор или NS5b фрагментов гибридизацией с типоспецифическими пробами.
Косвенным показателем наличия того или иного генотипа ВГС может служить определение серотипа вируса. Обнаружение типоспецифических В-клеточных эпитопов, кодированных регионами NS4a и NS4b, делает возможным проведение серотипирования. Разработаны лабораторные и коммерческие варианты для серотипирования ВГС методом ИФА. Фирма Мюрекс (Murex Diagnostics, Dartford, UK) представила тест для определения серотипа ВГС с 1 по 6, используя для этого пептиды, кодированные NS4 зоной РНК ВГС. К сожалению, серотипирование не дает возможность разграничить субтипы ВГС (например, 1а и 1b ). При проведении серотипирования анти-ВГС необходимо помнить, что полученный результат может свидетельствовать как о текущей, так и о ранее перенесенной инфекции, вызванной ВГС, без наличия у данного пациента вируса.
Информация о репликации ВГС до сих пор крайне ограничена и в большинстве случаев носит противоречивый характер. Это положение можно объяснить частично крайне низкими концентрациями вируса в организме больных и носителей ВГС, а также отсутствием, до недавнего времени, доступной модели экспериментальной модели гепатита С. Однако исследования, проведенные в России (Институт вирусологии им. Д. И. Ивановского) и в других странах (Канада), позволили разработать доступные экспериментальные модели "in vivo" и "in vitro". Продемонстрирована способность ВГС вызывать вирусспецифическую гибель новорожденных мышей, инфицированных в мозг. Репродукция ВГС получена в первичных культурах клеток головного мозга мышей-сосунков, а также в культуре клеток почки эмбриона свиньи. Другая модель "in vivo", созданная в Канаде, основана на имплантации линии клеток гепатомы человека (Huh-7) в печень голых мышей. После заражения Huh-7 клеток ВГС удавалось найти последовательности РНК ВГС в клетках печени и сыворотках крови мышей.
